透射式常压激光/光化学电离质谱成像源（t-AP-LDI/PI）用于生物组织代谢物原位成像

应用领域：生命科学；神经生物学；病理学诊断；

‌前言

质谱成像（MSI）是无标记、原位解析生物组织内代谢物、脂质、蛋白空间分布的核心分析技术，常压敞开式质谱成像因样品前处理简单、原位无损检测的优势被广泛关注。传统激光解吸电离（LDI）存在离子产率极低、灵敏度不足问题，本实验采用的透射式常压激光/光化学电离质谱成像源（t-AP-LDI/PI），采用氪灯真空紫外（VUV）软电离技术，搭配自主鼓泡掺杂供气系统，大幅提升分子离子化效率，无需基质即可实现脑组织、黑色素瘤临床组织中多类代谢物、脂质的高分辨空间分布成像，为神经生物学、肿瘤微环境代谢研究提供原位分析新手段。

‌实验材料与方法

仪器：透射式常压激光/光化学电离质谱成像源（t-AP-LDI/PI），搭配Agilent 6224高分辨飞行时间质谱（分辨率20000）。

试剂与载气：色谱级甲苯、甲醇、纯水；高纯氮气（99.999%）作为载气与掺杂输送气。

生物样品：

小鼠脑组织：小脑、海马组织液氮速冻，冷冻切片厚度10μm。

人体黑色素瘤组织：拇指皮肤肿瘤手术样本，液氮-80℃冷冻，10μm冷冻切片，配套H&E病理染色切片对照。

图1  t-AP-LDI/PI MSI的实验装置示意图

‌结果与结论

1、掺杂辅助后电离显著提升检测灵敏度

单纯透射常压激光解吸（t-AP-LDI）仅能检出极低丰度质谱信号，开启氪灯直接光电离后可检测更多小分子；通入甲苯掺杂剂发生质子转移、电荷交换，代谢物、脂质离子丰度提升1~3个数量级，一次性检出小鼠脑组织内超百种内源代谢物、脂质，覆盖氨基酸、神经递质、甘油酯、磷脂等多类物质，检测覆盖范围优于DESI/PI、MALDI、AP-MALDI等主流常压成像技术。

图2 （A）载玻片和传输管的距离与五种化合物的离子强度之间的关系。（B-D）小鼠脑匀浆在t-AP-LDI、无掺杂剂的t-AP-LDI/PI和有掺杂剂的t-AP-LDI/P1下的背景减除质谱图。（E）小鼠脑匀浆中代表性代谢物和脂质的倍数变化直方图，该图是通过t-AP-LDI/PI（含掺杂剂）/t-AP-LDI/PI（无掺杂剂）和t-AP-LDI/PI（无掺杂剂）/t-AP-LDI获得的。（F）正离子模式下t-AP-LDI/PI、DESI/PI、MALDI和AP-MALDI-MS的物种分类韦恩图。

2、小鼠小脑组织10μm分辨率分区代谢成像

正负离子模式下可清晰区分小脑分子层（ML）、颗粒层（GL）、白质（WM）亚区域分子分布特征：

颗粒层（GL）：组胺、腺嘌呤、鸟嘌呤、天冬氨酸富集，与神经核酸、神经信号传导相关；

分子层（ML）：二甘油酯（DG）等脂质集中分布；

白质（WM）：胆固醇、维生素D3大量富集，是细胞膜类固醇代谢核心区域；多类特征分子离子图像叠加可直观呈现三层组织互补代谢分布规律。

 图3 正/负离子模式下小鼠小脑的平均质谱和t-AP-LDI/PI质谱成像。（T，O）小脑的光学图像。ML，分子层，GL，颗粒层，WM，白质。样品台的步长设置为10μm。比例尺：500μm。

3、小鼠海马组织实现4μm超高空间分辨成像

4μm像素分辨率下可分辨海马CA1区、齿状回（DG）、胼胝体（CC）精细微区：腺嘌呤集中于神经元胞体富集的CA1、齿状回；胆固醇以点状分布于胼胝体，实现脑组织单细胞级微区代谢差异可视化。

图4 （C）通过t-AP-LDI/PI对小鼠海马组织切片的光学图像和（D-O）MS图像。在图（P）中可以观察到亚区之间的明显区别，包括CA1、齿状回（DG）、胼胝体（CC）和上丘臂（BSC）。光学图像中的黄色实线表示MSI区域，比例尺为100μm。

4、人体黑色素瘤临床组织解析肿瘤代谢异质性

对皮肤黑色素瘤切片分层成像，清晰区分角质层、颗粒层、肿瘤病灶、正常组织四大区域：

角质层：N-乙酰胺、GABA、天冬氨酸等保湿氨基酸高表达；

颗粒层：腺苷、长链二甘油酯特征富集；

肿瘤致密病灶：胆固醇、维生素D3、棕榈酸、油酸等脂肪酸显著上调，提示黑色素细胞异常增殖；

代谢通路：肿瘤内甘油三酯、磷脂合成通路激活，PI3K/AKT促侵袭通路相关磷脂分子大量累积，直观揭示肿瘤微环境代谢异质性，为黑色素瘤病理分子标志物筛选提供依据。

图5  t-AP-LDI/PI在正离子和负离子模式下对黑色素瘤中一些代表性化合物的MS图像。（A）黑色素瘤组织切片的光学和H＆E染色图像，以及不同黑色素瘤癌症组织区域的72.8倍放大的H＆E着色图像。黑色、绿色、红色和蓝色实线分别表示角质层、颗粒层、肿瘤组织（黑色素瘤细胞的密集区域）和正常组织。（B-K）在正离子模式下选择具有特征分布的离子图像。在负离子模式下选择具有特征分布的（M-P，R-U）离子图像。

结论

透射式常压激光/光化学电离质谱成像源（t-AP-LDI/PI），配套稳定鼓泡掺杂供气系统，解决了常压激光电离灵敏度低的短板，离子信号提升1~3个数量级。整套设备通用性强，可适配各类商用质谱进样口。

该方法无需复杂样品前处理，可实现10μm常规组织成像、4μm超高分辨脑组织微区成像，成功应用于小鼠神经组织、人体临床黑色素瘤切片，可视化氨基酸、神经递质、脂肪酸、各类脂质的空间分布，直观解析脑组织分区代谢规律与肿瘤微环境代谢异质性。

‌参考文献

[1] Qi, Keke; Lv, Yongmei; Xiong, Ying; Tian, Changlin*; Liu, Chengyuan*; Pan, Yang*, Development of Transmission Ambient Pressure Laser Desorption Ionization/Postphotoionization Mass Spectrometry Imaging (t-AP-LDI/PI MSI), Analytical Chemistry, 2024, accepted‌