组织经液氮或冷冻剂快速冻结后，在冷冻显微切片机中于恒定低温下用刀片切削成数微米至十余微米薄层。低温抑制酶活与扩散，使分子在原位“冻住”，从而降低前处理引起的空间失真。
相比需脱水、包埋、脱蜡的石蜡流程，冷冻切片绕开了有机溶剂暴露，对热敏感与易溶出的代谢物更友好。
冷冻切片保真度高，是空间代谢组学、药物分布与脂质成像的常用前处理；其与免基质常压源（LDPI、DPI、DESI）搭配时，可在切片后直接采样，链路短、扰动小。
对需要亚细胞分辨率的成像，冷冻流程还可与冷冻质谱成像源协同，在低温链路上锁定原位分布，避免解冻造成的分子迁移。
关键参数包括冷冻速率（影响冰晶大小）、切片温度、厚度与刀具状态。冰晶过大会破坏微结构，温度不稳会引入刀痕或皱褶。切片后应尽快成像或低温保存以防升华与降解。
若需后续 H&E 或 IHC 注释，冷冻切片同样可兼容，但需注意染色流程对质谱靶面的影响；导电载玻片则用于需导电的真空源（如 TOF-SIMS）。
冷冻切片应纳入标准成像 SOP：统一冻存、切片厚度与转移条件，保证多样本可比。切片质量与后续基质喷涂（若用 MALDI）或免基质采样（LDPI/DPI）共同决定最终图像质量。
对免基质常压成像线，推荐“冷冻切片→直接采样”的短链路，以最大化保留小分子空间信息。
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