质谱成像需在平面上逐点采样以获取坐标；立体组织无法直接扫描，必须切成薄层暴露截面。切片厚度与平整度影响激光/喷雾/离子束的采样一致性，进而决定像素间可比性。
此外，切片过程若引起分子迁移或降解，会抹平真实空间分布。因此切片工艺与后续固定、保存共同决定“原位”信息的保真度。
常用石蜡包埋切片与冰冻切片：石蜡切片形态保持好但需脱蜡且可能引入溶剂扰动；冰冻切片（冷冻切片）在低温下切削，更利于保留小分子与代谢物，是质谱成像首选。导电载玻片可用于需导电的真空源（如 TOF-SIMS）。
对免基质常压源（LDPI、DPI、DESI），切片后通常直接采样或仅做 minimal 处理；对 MALDI 则需额外基质喷涂，切片质量同样影响基质均匀性。
切片需与下游读出兼容：若计划 H&E 染色或 IHC 形态注释，切片应兼顾质谱与染色的可操作性；若用导电载玻片，还需考虑靶面与离子传输的匹配。
标准化切片 SOP（厚度、温度、刀具、转移）是跨项目可比性的基础，应写入成像实验规范并与分析软件配准流程衔接。
误区包括切片过厚导致采样穿透不均、解冻造成分子迁移、刀痕引入伪影。质控可通过光学显微镜初检、基质均匀性检查与已知分子信号验证进行。
对要求亚细胞分辨率的成像，切片质量更是瓶颈之一；此时需配合冷冻质谱成像源与低温稳定流程，避免前处理成为分辨率天花板。
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